Μελέτη του ρόλου των microRNAs στη ρύθμιση των μηχανισμών αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του αμνιακού υγρού

Abstract

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μονόκλωνα μόρια RNA, μήκους 20-23 nt, που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση, αλληλεπιδρώντας με ειδικές θέσεις της 3' αμετάφραστης περιοχής (3' UTR) του mRNA συγκεκριμένων γονιδίων, προκαλώντας αναστολή της μετάφρασης. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι τα miRNAs μπορούν να δρουν ως ρυθμιστικά σηματοδοτικά μόρια καθορίζοντας τις χαρακτηριστικές ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων ενήλικης ή εμβρυϊκής προέλευσης. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) αποτελούν ένα πληθυσμό προγονικών κυττάρων με δυνατότητα διαφοροποίησης σε επιμέρους ιστούς της μεσεγχυματικής σειράς και με ικανότητα in vivo αποκατάστασης του ομόλογου ιστού. Οι κύριες πηγές MSCs είναι ο μυελός των οστών (BM), το αίμα ομφαλίου λώρου (UCB) και το αμνιακό υγρό (AF). Από την ερευνητική μας ομάδα έχει ήδη πραγματοποιηθεί α) απομόνωση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του αμνιακού υγρού (AF-MSCs), β) φαινοτυπικός χαρακτηρισμός τους, γ) πιστοποίηση του υψηλού ρυθμού πολλαπλασιασμού τους, δ) εκτίμηση του φάσματος διαφοροποίησής τους και ε) ανάλυση του πρωτεωμικού τους προτύπου. Επιπρόσθετα μελετήθηκε, για πρώτη φορά, η παρουσία δύο μορφολογικά διακριτών υποπληθυσμών κυττάρων στις αρχικές αποικίες των AF-MSCs, σχήματος ατρακτοειδούς [spindle-shaped (SS)] ή σφαιρικού [round-shaped (RS)], οι οποίοι ονομάστηκαν SS-AF-MSCS και RS-AF-MSCs, αντιστοίχως. Λεπτομερής ανάλυση των δύο αυτών υποπληθυσμών, κατόπιν μηχανικού διαχωρισμού τους, έδειξε ότι τα SS-AF-MSCs εκφράζουν τον αντιγονικό δείκτη Thy-1 (CD90) σε μεγαλύτερο ποσοστό, παρουσιάζουν υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού και ευρύτερο φάσμα διαφοροποίησης σε σχέση με τα RS-AF-MSCs. Με σκοπό την εμπεριστατωμένη μελέτη της μοριακής ταυτότητας των δύο αυτών υποπληθυσμών, έγινε συστηματική ανάλυση του πρωτεωμικού τους προτύπου, πριν την ενδεχόμενη αξιοποίησή τους σε in vivo θεραπευτικές δοκιμές. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η μελέτη της μετά-μεταγραφικής ρύθμισης τριών πληθυσμών MSCs από AF, BM και UCB, σε επίπεδο προτύπου έκφρασης των miRNAs με τη χρήση miRNAs μικροσυστοιχιών. Τα miRNAs είναι μονόκλωνα μόρια RNA, μήκους 20-23 nt, που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση, αλληλεπιδρώντας με ειδικές θέσεις της 3' αμετάφραστης περιοχής (3' UTR) του mRNA συγκεκριμένων γονιδίων, προκαλώντας αναστολή της μετάφρασης. Ανιχνεύθηκαν 67 διαφορετικά εκφραζόμενα miRNAs στους τρεις τύπους MSCs. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι το miR-21 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα RS-AF-MSCs και στα BM-MSCs σε σύγκριση με τα SS-AF-MSCs. Με στόχο τη διερεύνηση του ρυθμιστικού ρόλου του miR-21 στην βλαστικότητα των AF-MSCs, περιγράφηκε για πρώτη φορά η άμεση αλληλεπίδραση του miR-21 με τον δείκτη βλαστικότητας Sox2. Η επαγωγή της έκφρασης του miR-21 στα SS-AF-MSCs, προκάλεσε σημαντική καταστολή της έκφρασης του Sox2. Το γεγονός αυτό οδήγησε στην στατιστικά σημαντική μείωση της κλωνογονικής ικανότητας και του ρυθμού πολλαπλασιασμού των SS-AF-MSCs. Επιπρόσθετα, μετά την επαγωγή της έκφρασης του miR-21 στα SS-AF-MSCs διαπιστώθηκε μείωση της έκφρασης των κυκλινών D1, E1 και A και αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1/G0. Παράλληλα, διαπιστώθηκε αυξημένο ποσοστό κυτταρικής γήρανσης στα SS-AF-MSCs που εκφράζουν miR-21. Αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μετά την καταστολή της έκφρασης του miR-21 στα RS-AF-MSCs και στα BM-MSCs, όπου διαπιστώθηκε αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Επίσης, η επαγωγή του miR-21 ενίσχυσε την ικανότητα διαφοροποίησης SS-AF-MSCs προς οστεοκύτταρα και μείωσε την ικανότητα διαφοροποίησης τους προς λιποκύτταρα και χονδροκύτταρα. Ακολούθησε λεπτομερής ανάλυση του προτύπου έκφρασης των miRNAs των SS-AF-MSCs σε σύγκριση με αυτό των διαφοροποιημένων SS-AF-MSCs προς λιποκύτταρα. Αναγνωρίστηκαν 13 διαφορετικά εκφραζόμενα miRNAs και από αυτά ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε το miR-26a, το οποίο εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα στα λιποκύτταρα σε σύγκριση με τα αδιαφοροποίητα SS-AF-MSCs. Η επαγωγής της έκφρασης του miR-26a προκάλεσε μείωση στον ρυθμό πολλαπλασιασμού των SS-AF-MSCs, μείωση των επιπέδων έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων Sox2, Oct4 και Nanog και καταστολή της ικανότητας τους να διαφοροποιούνται προς λιποκύτταρα. Συμπερασματικά, βασιζόμενοι στα παραπάνω αποτελέσματα διακρίνεται ότι το miR-21 ρυθμίζοντας τα επίπεδα έκφρασης του Sox2 μπορεί να επιδρά σε βασικές κυτταρικές διεργασίες των MSCs και να είναι ένα μόριο «κλειδί» για τον καθορισμό της πολλαπλασιαστικής τους ικανότητας καθώς και της ικανότητας του να διαφοροποιούν. Επιπρόσθετα, το miR-26 είναι πιθανό να αποτελεί ρυθμιστικό μόριο της διαφοροποίησης των SS-AF-MSCs προς λιποκύτταρα in vitro.