Genetic, molecular, biochemical and biophysical approaches in studying structure – function relations in transmembrane purine transporters

Abstract

Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες μεταφοράς διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη, διαφοροποίηση και επιβίωση των ευκαρυωτικών κυττάρων. Πολλές ανθρώπινες ασθένειες έχουν συνδεθεί με δυσλειτουργία ή τροποποιημένη λειτουργία μεμβρανικών μεταφορέων, όπως η κυστική ίνωση και η αδρενολευκοδυστροφία. Εξαιτίας τεχνικών δυσκολιών, δεν είναι δυνατή η κρυστάλλωση και απόδοση της τρισδιάστατης δομής όλων των πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό, μια πρώτη ιδέα για την αναδίπλωση των διαφόρων περιοχών της πρωτεΐνης θα μπορούσε να ληφθεί μέσω μοντέλων ομολογίας, εάν υπάρχει διαθέσιμη μια αντιπροσωπευτική κρυσταλλογραφική δομή. Τα τελευταία χρόνια έχει κρυσταλλωθεί ένας μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών μεταφοράς, και μέσω αυτών έχουν δημιουργηθεί μοντέλα ομολογίας συγγενικών πρωτεϊνών. Τέτοιο παράδειγμα αποτελούν οι μεταφορείς δευτερογενούς ενεργότητας. Καθώς η κρυσταλλογραφία αποδίδει ένα στατικό, μόνο, στιγμιότυπο δυναμικών πρωτεϊνικών δομών έξω από τη λιπιδική διπλοστοιβάδα, η οποία αποτελεί τη φυσική τους τοπολογία, απαιτούνται ταυτόχρονα και άλλες βιολογικές προσεγγίσεις. Προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι παράγοντες που καθορίζουν την εκλεκτικότητα του υποστρώματος σε δομές με χαμηλή πρωτοταγή ομολογία, αλλά υψηλή δομική ομοιότητα είναι επιτακτική η συνδυαστική χρήση δεδομένων κρυσταλλογραφίας καθώς και συστηματικής μεταλλαξιγένεσης. Η τελευταία αυτή βιολογική προσέγγιση σε συνδυασμό με την κατασκευή μοντέλου ομολογίας μπορεί να αποτελέσει μια αποτελεσματική και αξιόπιστη προσέγγιση στη μελέτη των σχέσεων δομής-λειτουργίας των μεταφορέων δευτερογενούς ενεργότητας. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν με βιοφυσικές και γενετικές/μοριακές προσεγγίσεις δύο μεταφορείς πουρινών στον πρότυπο ασκομύκητα Aspergillus nidulans, ο UapA και ο FcyB.

Membrane transport proteins play a crucial role in development, differentiation and survival of eukaryotic cells. Many human diseases have been linked to dysfunction or modified function of membrane transporters, such as cystic fibrosis and adrenoleukodystrophy. Due to technical difficulties, it is possible to crystallize and yield of all the three dimensional structure of proteins. For this reason, a first idea for the folding of the various regions of the protein could be obtained by homology modeling, if there is provided a representative crystallographic structure. In recent years a large number crystallize transport proteins, and these are created by homology models related proteins. Such an example is secondary activity transporters. As crystallography yields a static, single, dynamic snapshot protein structure outside of the lipid bilayer, which is the physical topology, requires time and other biological approaches. In order to clarify the factors that determine the selectivity of substrate structures with low primary homology but high structural similarity is imperative that the combined use of crystallographic data and systematic mutagenesis. The latter biological approach in conjunction with the construction Homology modeling can be an effective and reliable approach to the study of structure-function relationships of transporters secondary activity. In this PhD thesis were studied by biophysical and genetic / molecular approaches two purine transporters in the model ascomycete Aspergillus nidulans, UapA and FcyB.